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上海雅吉生物科技有限公司
主營產(chǎn)品： 免疫組化試劑盒，對照品，抗體，細胞血清，Elisa試劑盒 |
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2016-9-21 閱讀(164)
實驗方法原理 將抗Tac特異性單克隆抗體Ab1吸附于固相載體，識別細胞培養(yǎng)上清或血清等標本中Tac并與之結(jié)合。應用辣根過氧化物酶標記的識別另一種Tac表位的特異性單克隆抗體Ab2識別固定于固相載體的Tac并與之結(jié)合。通過酶催化底物顯色反映待檢標本中游離Tac的水平。
實驗材料 抗體PHA
試劑、試劑盒 緩沖液洗滌液稀釋液終止液
儀器、耗材 塑料板檢測儀水浴箱冰箱CO2孵箱加樣器
實驗步驟
1. 刺激外周血單個核細胞（PBMC）
取外周血10 ml，肝素抗凝，常規(guī)分離單個核細胞，加至24 孔細胞培養(yǎng)板，2×106 /孔，RPMI1640-10％ FCS＋PHA 3 μg/ml，Wellcome公司，37 ℃、5 ％CO2培養(yǎng)72 小時，收集上清，-20 ℃保存待測。同時設(shè)未加PHA對照組?？蛇x用病人血清為待測標本。
2. Ab1包被
用0.05 M pH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗Tac特異性單克隆抗體（Ab1）稀釋至5 μg/ml，加至ELISA板，100 μl/孔，4 ℃包被72 小時。
3. 封閉
1 ％BSA-PBS封閉，350 μl/孔，37 ℃孵育2小時。
4. 加樣
ELISA板用PBS-T洗液洗3次，PHA刺激單個核細胞培養(yǎng)上清及對照組上清或病人血清倍比稀釋至1∶1024，每一稀釋度取100 μl加至ELISA板。HUT-102B2細胞培養(yǎng)上清為陽性對照，RPMI1640-10％FCS培養(yǎng)液為陰性對照。37 ℃，孵育2 小時，洗滌。
5. 加酶標抗體
于各反應孔加辣根過氧化物酶標記另一種抗 Tac 特異性單克隆抗體Ab2以效價滴定的稀釋度稀釋100 μl。37 ℃孵育2小時，洗滌。
6. 加底物顯色
各反應孔加新鮮配制ABTS底物溶液100 μl，37 ℃，孵育15 分鐘。
7. 終止反應
各反應孔加2 ％氟化鈉終止液50 μl。
8. 結(jié)果判定
首先肉眼觀察反應孔內(nèi)顏色，稀釋梯度是否均勻。陽性、u性結(jié)果是否明顯。然后于ELISA檢測儀上測各孔OD值（410 nm）。
收起
注意事項
1. 包被抗體活性要較高，否則影響本實驗敏感性。
2. 經(jīng)篩選比較，封閉液以1 ％BSA-PBS為好。
3. 酶標結(jié)合物應用前應進行效價滴定，選擇工作濃度。
4. 底物應選用靈敏度較高的供氫體如ABTS等。
5. 如有條件，酶標McAb可由*-McAb和親和素-HRP系統(tǒng)代替，以增加實驗的敏感性。
