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B 淋巴細胞膜表面免疫球蛋白(SmIg)的檢查實驗

2016-9-20 閱讀(212)

實驗方法原理    SmIg 是B 細胞的抗原識別受體,也是B 細胞特異的表面標志,用直接免疫熒光法可檢查出SmIg。用熒光素標記的抗Ig 抗體,在一定條件下與淋巴細胞混合,熒光素標記的抗Ig 抗體可以與B 細胞表面的Ig 結合,在熒光顯微鏡下觀察可見B 細胞膜上出現熒光。此方法可用來鑒定B 淋巴細胞。
實驗材料    ICR 小鼠
試劑、試劑盒    異硫氰酸熒光素(FITC)標記的兔抗小鼠Ig 抗體Hank's液
儀器、耗材    臺式離心機離心管吸管移液管
實驗步驟    
1.  采用頸椎脫臼法處死小鼠,解剖取出脾臟放入盛有6 ml Hank's液的平皿中,用100 目鋼網研磨,混勻。從中吸取1 ml細胞懸液放入一試管中,加滿Hank's液,離心1000 rpm,10 分鐘,洗滌細胞一遍。傾去上清,沉積的細胞恢復1 ml容積,即為約1×107 /ml的細胞懸液。另取一支試管,吸取1×107 /ml的細胞懸液0.4 ml加Hank's液3.6 ml,即為1×106 /ml的細胞懸液。
 
2.  取2 ml離心管兩只,各加入1×106 /ml的細胞懸液1 ml,用臺式離心機離心2000 rpm,3 分鐘,棄去上清液。一支加入熒光素標記的兔抗鼠Ig抗體100 μl,另一支不加抗體作對照,置4 ℃冰箱30 分鐘。
 
3.  取出離心管,用Hank's 液洗滌細胞兩次,以去除游離的抗體,zui后一次離心后棄去上清液,留少許回流液,混勻,滴片,用熒光顯微鏡觀察。
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注意事項    
一、在滴片前要*去除游離的抗體,以避免假陽性結果。

 

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其他    
一、實驗結果
 
熒光顯微鏡觀察,落射激發(fā)光下SmIg 陽性細胞可見環(huán)狀或斑點狀熒光。用鎢絲燈光源透射光照明計數同一視野內淋巴細胞總數,共計數200~300 個淋巴細胞,算出其中SmIg 陽性細胞的百分數。



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