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Elisa常見樣本的處理方法

Elisa 是一種快速、靈敏、準(zhǔn)確可靠的一種定量分析方法，樣本的處理對于 Elisa 實(shí)驗(yàn)的成功有著舉足輕重的作用。利用 ELISA 進(jìn)行檢測的樣本類型包括常 見的血液（血清、血漿），組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清以及不常見的 皮膚組織、尿液、糞便、肺泡灌洗液、唾液、腦脊液、胸腹水、前列腺液、液、道分泌物等，這些樣本收集的時間、處理方法和保存都會影響到 Elisa 實(shí) 驗(yàn)的結(jié)果。下面我們就常見的樣本處理方法，供研究者參考。

1、 血液樣本

血液采取后應(yīng)盡快進(jìn)行處理，使血清（漿）從與血細(xì)胞接觸的全血中分離 出來。

血清與血漿的區(qū)別：

血清是血液凝固后缺少纖維蛋原的血漿，故血漿中除尚含有纖維蛋白原和 抗凝劑外，其他成份均等同于血清。

選擇血清還是血漿樣本？

由于血清中缺乏很多的*，但有一些凝血產(chǎn)物，如果是測* 建議選擇血漿樣本；同時血漿中有纖維蛋白原，如果纖維蛋白原對待檢測指標(biāo) 有影響，建議選擇血清樣本。大多數(shù)情況下二者均可以選擇。

處理方法：

血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置 2 小時或 4 度過夜，然 后 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可。這是一個讓血液自然凝固的過程，溫度 溫度越低，凝集越緩慢，可根據(jù)需要添加促凝劑。

血漿：血漿樣本需要抗凝，一般建議用 2.0%EDTA，1%肝素，3.8%枸櫞酸 鈉作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的 30 分鐘內(nèi)于 2 ~8 度 1000 g 離心 15 分鐘，取上清即可檢測。根據(jù)待檢測目標(biāo)物的性質(zhì)不同選取不同的抗凝劑。

*(檸檬酸鈉）：Ca2+有凝血作用，*能與血液中的鈣離子形 成可溶性的螯合物，從而阻止血液凝固。配成 109mmol/L 的濃度和血液 1:9, 106mmol/L 的濃度和血液 1:4。

缺點(diǎn)：血液中溶解度低，抗凝作用較弱。

優(yōu)點(diǎn)：對*有很好的保護(hù)作用，大部分凝血試驗(yàn)都可用*抗 凝。

乙二胺四乙酸（EDTA）鹽：與血液中的鈣離子結(jié)合形成配位化合物， 從而阻止血液凝固。15g/L EDTA 和血液 1:10。

優(yōu)點(diǎn)：對紅細(xì)胞和白細(xì)胞形態(tài)影響小。

缺點(diǎn)：影響血小板的聚集。不適用于凝血實(shí)驗(yàn)和血小板功能相關(guān)實(shí)驗(yàn)的檢 測。

肝素：通過與抗*Ⅲ結(jié)合，增強(qiáng)抗*的作用，滅活*蛋白 酶，從而可阻止*的形成和阻止血小板聚集，阻止血液凝固。* 1g/L 與血液 1:10。

優(yōu)點(diǎn)：抗凝能力強(qiáng)、不影響血細(xì)胞體積、不易溶血、能耐高溫。

缺點(diǎn)：引起白細(xì)胞聚集。肝素抗凝血應(yīng)于短時間內(nèi)使用，否則放置過久血 液又可凝固。

2、 組織樣本

組織樣本一般是制成組織勻漿，處理方法如下。

1）取適量組織塊，于預(yù)冷 PBS（0.02mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液， 稱重后備用（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）；

2）可同時選用多種勻漿方法達(dá)到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃 勻漿器，加入 5-10ml 預(yù)冷 PBS(組織與 PBS 的質(zhì)量體積比建議為 1:5，即 1g 樣 本加入 5ml PBS)進(jìn)行充分研磨（有條件實(shí)驗(yàn)室可選用機(jī)器勻漿），該過程需在冰 上進(jìn)行；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復(fù)凍融進(jìn)一步處理（超聲破碎過 程中注意冰浴降溫；反復(fù)凍融法可重復(fù) 2 次）。

3）將制備好的勻漿液于 5000×g 離心 5 分鐘，留取上清即可檢測。

4）如果樣本需要*保存，請?zhí)砑拥鞍酌敢种苿?。根?jù)實(shí)驗(yàn)需要，組織勻 漿樣本可先定量總蛋白,以便于統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。某些組織樣本如肝臟，腎臟，腦 組織會有假陽性反應(yīng)。

3、 細(xì)胞樣本 細(xì)胞樣本根據(jù)目的物所在部位可選擇細(xì)胞裂解液或細(xì)胞培養(yǎng)上清作為樣 本。需要注意的是：因該類樣本干擾因素較多，如細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量(大于 10^6)、 ph(約為 7)、培養(yǎng)基鹽離子濃度、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況。 如果目的物是分泌型，主要在胞外，即可選擇細(xì)胞培養(yǎng)上清作為樣本，如果目 的物主要存在于胞內(nèi)，則建議選擇細(xì)胞裂解液作為樣本類型。

細(xì)胞培養(yǎng)上清處理方法相對簡單，取細(xì)胞培養(yǎng)上清，1000×g 離心 20 分 鐘，取上清即可檢測。

細(xì)胞裂解液：

1）貼壁細(xì)胞需要先用*消化，離心收集細(xì)胞（懸浮細(xì)胞可直接離心收 集）；

2）將收集到的細(xì)胞用冷 PBS 洗 3 次；

3）物理方法裂解細(xì)胞（可先超聲破碎細(xì)胞，再反復(fù)凍融）：

    i 超聲破碎：取適量 PBS 重懸細(xì)胞，用一定功率的超聲波處理細(xì)胞 懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂；

    ii 反復(fù)凍融：將待破碎的細(xì)胞在-20 度以下冰凍，室溫融解，反復(fù) 3 次，使細(xì)胞溶脹破碎；

4）將標(biāo)本于 2-8 度 1500×g 離心 10 分鐘，收集上清備用。

一般情況下，物理方法如反復(fù)凍融，勻漿等方法會比化學(xué)方法好，因?yàn)榛?學(xué)方法會引入酸或堿，可能會對 elisa 實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響。我們也做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)來評 測化學(xué)提取液和洗滌劑對 ELISA 檢測的影響，如 RIPA、TritonX-100、NP-40 和 SDS、脫氧膽酸鈉、β巰基乙醇、DTT